另辟蹊径,合成DNA更快更便宜

今天从劳伦斯·伯克利国家实验室(Lawrence Berkeley National Laboratory)看到一则新闻,两名研究生发明了一种新型DNA合成方法,让人拍案叫绝。结合自己的粗浅知识,分享一下。

在生命科学研究和基因检测领域,常常涉及到人工合成的DNA片段(oligo)。比如,PCR实验要用到引物,合成生物学需要用到完整的人工基因。业界将人工合成DNA片段的过程叫做oligo合成。

现有方法

当前广泛使用的oligo合成技术是Caruthers法,诞生于40年前。DNA的基本构件是四种单体,分别用字母A、G、C、T表示。不同的单体按一定序列组成DNA片段,一般称为寡核苷酸(oligo)。Caruthers法的基本原理,是在固体表面上,挨个将单体接上去。

Caruthers法的每一步都是典型的有机合成过程。每增加一个单体,要经过四个有机反应。为了获得正确的序列,这些单体都是经过修饰的有机试剂。合成过程中也要用到大量的有机溶剂。与一般的有机合成过程相比,Oligo合成很容易自动化,有多种自动化合成仪出售。

由于基因检测、合成生物学的蓬勃发展,oligoh合成需求旺盛,逐渐形成了一个不小的产业链,诞生了一些专门从事Oligoh合成的公司,其中最著名的是Integrated DNA Technologies (简称IDT)。使用oligo的研究人员不需要自己做合成了,只要登录IDT的网站,提交所需的oligo序列,一周左右就能收到货。

然后,像多数有机合成方法一样,Caruthers法也有其缺陷。首先,合成的oligo不能太长,否则最终产率会低到无法使用。如果每增加一个单体的产率是99.5%的话,合成200的单体长度的oligo,最终的产率只有37%。对合成生物学来说,含有1000个碱基的DNA片段也不嫌长,因此常常要通过拼接几个oligo,得到足够长的基因。其次,费用高昂。如果要合成1000个基因,每个300美元,那么费用就高达30万美元。其三,合成的速度比较慢。有一些公司已经可以提供快速服务,一天内合成15-20个碱基长度的oligo,但费用也相应地水涨船高。

另辟蹊径

数十年来已有不少人尝试酶法,进行oligo合成,但都以失败告终。转机来自于劳伦斯·伯克利国家实验室的两名研究生,Sebastian Palluk和Daniel Arlow。

人们发现,脊椎动物体内有一种酶,可以催化oligo的合成。这种酶叫做末端脱氧核糖核苷酸基转移酶,比较拗口,因此简称为TdT。

为了得到所需系列的oligo,TdT要让某个单体连接到片段上,停止反应,直到另一个单体加入反应体系。如果给单体带上特殊的保护基,就能防止多余的反应。然而,TdT上的催化位点不够大,带保护基的单体无法与之接近。人们试图通过突变的方法,在TdT上“钻个洞”,这样就能容纳带保护基的单体,然而这种尝试没有成功 。

Palluk和Arlow不走寻常路,想到了一个点子:把单体和TdT连接起来,等单体添加到片段上后,再将TdT剪切掉。如此一来,每次就能在片段上增加一个单体,避免副反应发生。TdT不再只起到催化的作用,还变成了反应试剂。

这种方法有点反直觉,因此受到一些人的嘲笑。然而,Palluk和Arlow还是成功地合成了一个10个单体长度的oligo。他们的成果发表在知名学术杂志Nature Biotechnology上。

前景广阔

新方法尚不成熟。经过数十年的优化,传统合成方法能达到每步产率为99.5%。新方法只能达到每步产率98%。如果要合成200个单体长度的oligo,新方法的最终产率不到2%,相当不实用。

尽管如此,新方法的发明者还是信心满满,认为产率问题会很快被克服。他们有望实现每分钟200个碱基的合成速度。

最近几年,CRISPR-Cas9等基因编辑技术的普及,对合成oligo的需求会越来越大。新的oligo合成方法出现得正是时候,无疑会推动相关领域的发展。

参考资料

Faster, Cheaper, Better: A New Way to Synthesize DNA

De novo DNA synthesis using polymerase-nucleotide conjugates